重組人溶菌酶的研究進(jìn)展
龐戀蘇 李亞男
【摘要】 人溶菌酶是一種人體內天然存在的具有抗菌、抗病毒、抗炎、增強免疫力等特性的蛋白質(zhì)。它直接作用于細菌細胞壁，因此，細菌對其完全不存在耐藥性，也無(wú)免疫原性。利用基因工程生產(chǎn)出的重組人溶菌酶不僅具有人溶菌酶的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也克服了人溶菌酶活性低、產(chǎn)量低、不便于制備、無(wú)法穩定保存等缺點(diǎn)。在抗菌藥物濫用、耐藥菌株廣泛存在的今天，由于其特性可以彌補眾多抗生素的不足，具有廣泛的臨床應用前景。本文就針對重組人溶菌酶的研究進(jìn)展做一綜述。
關(guān)鍵詞：溶菌酶；重組人溶菌酶；藥理作用；生物功能
[中國圖書(shū)分類(lèi)號] R780. 1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672- 2973(2017)05- 0306- 04
Research progress of recombinant human lysozyme
PANG Lian-su, LI Ya-nan (Department of stomatology, Chinese PLA General Hospital and Chinese PLA Medical school, Beijing 100853, China)
[ Abstract] Recombinant Human lysozyme is a kind of protein that has antibacterial, anti-viral, anti - inflammatory and immunological properties. Recombinant human lysozyme is a natural antibacterial agent, directly acting on bacterial cell wall. It has no drug resistance in bacteria and immunogenicity. Recombinant human lysozyme not only has the advantage of human lysozyme but also has better antibacterial activity, more production, easy to prepare and stable preservation. It has very promising clinical application prospectespecially bacterial resistant strains are widespread. The research progress of recombinant human lysozyme is reviewed.
Key words: Lysozyme; Recombinant human lysozyme; Pharmacological; Biological functions
* 基金項目：企事業(yè)單位合作課題(項目編號: HXKTLIYANAN001)
龐戀蘇 解放軍醫學(xué)院 碩士生 北京 100853
李亞男 通訊作者 解放軍總醫院口腔修復科副主任醫師 副教授 北京 100853
溶菌酶起源于 1922 年 Fleming 在人的鼻粘液中發(fā)現一種能夠溶解細菌細胞壁的物質(zhì)，并將其命名為“Lysozyme”，即溶解細菌的蛋白質(zhì)。溶菌酶全稱(chēng) 1, 4- β- N 乙酰胞壁酸聚糖水解酶，又稱(chēng)為細胞壁溶解酶，在高等動(dòng)物的體液中分布廣泛，它具有抗菌、抗病毒、消炎、增強免疫力等特性[1]。隨 著(zhù)日益出現的耐藥型細菌以及人體對抗生素類(lèi)藥物的嚴重不良反應，急需要一種新型的無(wú)耐藥性、無(wú)抗原性、無(wú)毒性的抗菌藥物，基因工程技術(shù)的發(fā)展使得重組人溶菌酶得以生產(chǎn)，人們期待將重組人溶菌酶用于臨床。
1. 人溶菌酶的分子結構和理化生物特性
人溶菌酶是由 130 個(gè)氨基酸組成的單肽鏈蛋白質(zhì)，是一種陽(yáng)離子堿性蛋白質(zhì)，呈白色結晶狀或無(wú)定形粉末固相，常溫即可溶于水，化學(xué)性質(zhì)穩定， 最適宜溫度是 25℃，在高溫和酸溶液環(huán)境中活性也保持穩定，堿溶液中不穩定，天然人溶菌酶主要存在于人體體液、組織內外細胞液和人體器官中， 作為一種重要的非特異性體液免疫因子，若缺乏可導致嚴重的免疫系統疾病。溶菌酶在人體唾液中以游離和復合物這兩型存在：
(1)游離型主要是呈團簇狀的陽(yáng)離子蛋白質(zhì)；
(2)復合物型與陰離子蛋白質(zhì)、多糖、大分子物質(zhì)共同組成[2]。細菌細胞壁溶菌酶根據靶向作用的位點(diǎn)不同，可以細分為作用于β- 1, 4 糖苷鍵和作用于肽“尾”這兩種類(lèi)型，溶解真菌的主要是依賴(lài)裂解酵母菌細胞壁和霉菌細胞壁的溶菌酶。
溶菌酶溶菌作用機制是借助于幾種酶或非酶物質(zhì)共同作用溶解細菌細胞壁達到殺菌效果，哺乳動(dòng)物體內細胞無(wú)細胞壁，不存在肽聚糖，溶菌酶無(wú)靶向位點(diǎn)，故對人體細胞不會(huì )產(chǎn)生破壞作用。因為革蘭氏陰性細菌只有內層壁為肽聚糖，而革蘭氏陽(yáng)性細菌細胞壁幾乎全部由肽聚糖組成，所以人溶菌酶抗革蘭氏陽(yáng)性菌效應高于革蘭氏陰性菌[3]。真菌細胞壁中的連接鍵幾丁質(zhì)也是人溶菌酶的底物，人溶菌酶可以使其 β- 1, 4 糖苷鍵斷裂而使細胞壁溶解，并且 PH= 5 是溶解幾丁質(zhì)最好的條件，因此溶菌酶可以溶解真菌細胞壁而治療其引起的感染[4]。人溶菌酶蛋白質(zhì)抗病毒機制是雙方所帶的異種電荷能夠緊密結合在一起，與病毒 DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，破壞病毒內部結構達到使病毒失活的作用[5]。溶菌酶還有改善和增強巨噬細胞細胞免疫的作用，使白細胞增多、減輕內毒素的作用，使機體受損可以通過(guò)加快自身免疫反應并釋放炎癥因子[6]。同時(shí)，人溶菌酶能夠激活血小板、發(fā)揮并加強人體第二道防線(xiàn)功能，從而實(shí)現抗菌、消炎、止疼等作用。人體中溶菌酶的分布和含量體現了某些疾病的發(fā)生、發(fā)展，可作為疾病診斷的重要指標。
2. 重組人溶菌酶藥效學(xué)研究
呂秋軍[7]學(xué)者發(fā)現重組人溶菌酶具有較強的抗菌性能。對革蘭氏陽(yáng)性菌如金葡球菌、表皮葡萄糖球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌活性強，尤其對耐藥菌有效，與其他抗生素聯(lián)用后， 體外抑菌活性明顯增強，還具有抗炎、鎮痛作用， 在急性、長(cháng)期毒性試驗中，wistar 大鼠、獼猴均未發(fā)現毒性靶器官，為后期制備抗耐藥菌新藥提供參考。多項研究實(shí)驗證明，對重組人溶菌酶和溶菌酶標準品抑菌活性的比較試驗中，重組人溶菌酶對致病菌與益生菌的抑菌性能均明顯強于溶菌酶標準品，它表現出更優(yōu)異的低劑量即達到標準溶菌酶的抗菌活性[5]。已有研究證明溶菌酶可以抗冠狀皰疹病毒、腺病毒生長(cháng)，也可用于帶狀皰疹、腮腺炎、雞水痘、肝炎及流感等病毒性疾患的治療[8]，也有研究資料提示，人溶菌酶是抗HIV 感染、抗SARS 的輔助治療藥物[9]。
Tenovuo 等[10]臨床研究顯示，將口腔牙膏與溶菌酶混合可更有效的預防齲齒，效果優(yōu)于直接添加抗菌劑。變形鏈球菌是目前公認的可疑致病菌[11]， 溶菌酶能夠破壞變形鏈球菌的細胞壁完整性達到抗齲的效果。牙周炎[12]主要認為是細菌的菌群紊亂導致，優(yōu)勢菌群的存在，破壞牙周膜細胞從而發(fā)病，
而重組人溶菌酶通過(guò)抑制優(yōu)勢菌可以改善疾病。牙齒釉質(zhì)表面覆蓋的一層薄膜中含有溶菌酶，它可以隔離外界環(huán)境對牙釉質(zhì)的酸蝕破壞，提示可以通過(guò)制備溶菌酶制劑達到護齒的目的。Samaranayake 等[13]體外模型研究發(fā)現，少量的溶菌酶即可抑制念珠菌生物膜的形成。重組人溶菌酶和抗真菌劑同時(shí)使用還具有協(xié)同作用，能夠有效抑制真菌感染。
3. 重組人溶菌酶制備與臨床轉化應用研究
人溶菌酶存在提取困難和活性難以保證等問(wèn)題，現國內生產(chǎn)的溶菌酶制劑主要是從雞蛋的蛋殼和蛋清中提取得來(lái)的，可以進(jìn)行規?；a(chǎn)，并已經(jīng)進(jìn)入臨床應用。國外則以動(dòng)物和霉菌為原料進(jìn)行生產(chǎn)，在大腸桿菌、酵母菌以及動(dòng)物、植物中都有表達重組人溶菌酶的相關(guān)研究。1986 年Murakami[14] 在啤酒酵母中表達出的重組人溶菌酶因為包涵體形式存在而不具有活性，后又在大腸桿菌上表達生產(chǎn)人溶菌酶，但都存在產(chǎn)量小，活性低的問(wèn)題。1988 年 Yoshimura 等[15, 16]學(xué)者通過(guò)接上一段雞溶菌酶信號肽，從而使啤酒酵母分泌了有活性的人溶菌酶。2001 年賈向志等[17]在巴斯得畢赤酵母上得到重組人溶菌酶的表達，但低等宿主中表達的重組人溶菌酶時(shí)常會(huì )以不溶的包涵體形式存在而無(wú)活性， 表達產(chǎn)量也無(wú)法達到要求。經(jīng)過(guò)近 20 年的研究， 采用單分子克隆技術(shù)構建重組表達質(zhì)粒，篩選出能夠高表達的人溶菌酶的工程菌，發(fā)現巴斯得畢赤酵母菌具有高效表達、穩定遺傳的特點(diǎn)，打破了低等生物表達產(chǎn)物活性低的瓶頸。結合巴斯得畢赤酵母營(yíng)養要求低、可高密度發(fā)酵、穩定遺傳性強等優(yōu)點(diǎn)，重組人溶菌酶可以在臨床上廣泛應用?？裳芯恐饾u發(fā)現，從各種微生物原材料中提取人溶菌酶仍存在一些固有缺陷：(1)生物原材料無(wú)法保證每一物種都能夠高產(chǎn)量、穩定表達；(2)物種來(lái)源也容易受到污染，是否在傳代的過(guò)程中不產(chǎn)生物種隔離； (3)生物活性不容易穩定遺傳，持續性無(wú)法得到保證。經(jīng)過(guò)幾十年的研究，現利用 DNA 重組技術(shù)動(dòng)物反應器表達獲得產(chǎn)物就可以克服這些問(wèn)題，通過(guò)轉基因技術(shù)表達重組人溶菌酶與天然人溶菌酶理化性質(zhì)、生物活性總體上無(wú)差別。
2006 年 Murray [18]小組已經(jīng)成功在山羊乳腺中得到表達并穩定遺傳，國內李寧院士[19]的團隊2011 年在奶牛乳腺上得到表達，并獲得高產(chǎn)和穩定遺傳。動(dòng)物乳腺生物反應器生產(chǎn)的重組人溶菌酶與天然人體產(chǎn)生的溶菌酶并無(wú)顯著(zhù)差別[20]。奶牛生物反應器可以高表達出重組人溶菌酶，也可以減少奶牛乳腺炎的發(fā)病率，奶液更加健康，其體內常見(jiàn)益生菌也未受到抑制。重組人溶菌酶還可以提高仔豬抗腹瀉的能力[21, 22]。
由于重組人溶菌酶的廣譜抗菌特性，又安全無(wú)毒副作用，已用在食品加工、副食品產(chǎn)品制作中， 醫療衛生也已經(jīng)有各種溶菌酶藥物劑型，主要應用于上呼吸道感染、口腔等疾病。人溶菌酶作為一種非特異性免疫蛋白，它能夠在自身免疫中發(fā)揮及其重要的作用，是人類(lèi)機體免疫的第一道防線(xiàn)。對口腔內牙周炎、齲齒、復發(fā)性阿弗他潰瘍、扁平苔蘚、智齒冠周炎、天皰瘡的治療均有一定作用[23]。我國復旦大學(xué)學(xué)者[24]進(jìn)行了多中心、隨機、雙盲、 多劑量平行對照評價(jià)重組人溶菌酶噴霧劑治療咽炎、扁桃體炎的療效及安全性的研究，現提示療效及安全性均較好，但缺乏長(cháng)期的臨床試驗觀(guān)察及數據分析，臨床上應用仍需要進(jìn)一步數據支持。
3. 重組人溶菌酶研發(fā)的優(yōu)勢與存在的問(wèn)題
綜上，重組人溶菌酶是一種廣譜抗菌、抗病毒藥物，能夠有效殺死毒性微生物并保護自身不受損害，同時(shí)與其他藥物相互作用無(wú)交叉反應。具有上述優(yōu)點(diǎn)，使得重組人溶菌酶可以在畜牧業(yè)、食品產(chǎn)業(yè)、臨床治療中得到發(fā)展。因為它的應用十分廣泛，也引起了世界衛生組織、糧食農業(yè)組織的重視，現已經(jīng)用來(lái)抗仔豬腹瀉病、抗山羊、奶牛乳腺炎，也可以做食品的防腐劑，已用在青稞、肉制品、以及牛奶的保質(zhì)防腐等用途上?，F在已經(jīng)進(jìn)行藥用生產(chǎn)的主要是雞蛋蛋清溶菌酶，而它僅是重組人溶菌酶活性的 1/ 3，同時(shí)由于異源性對人體有免疫排斥反應，也無(wú)法對抗機體內的細菌、病毒等。人溶菌酶熱穩定性也要遠高于雞蛋清溶菌酶，蛋清溶菌酶較于人溶菌酶抗菌譜較窄，而且人溶菌酶還有多種自身獨有的藥理作用，如抗炎、抗病毒、增強免疫力及抗腫瘤等。
目前用于商品化的人溶菌酶多從人乳汁和胎盤(pán)中提取，存在著(zhù)來(lái)源受限、產(chǎn)量極低、質(zhì)量不穩定、含有未知病原、價(jià)格高昂等問(wèn)題，不能滿(mǎn)足于市場(chǎng)需求。對于重組人溶菌酶的大規?；a(chǎn)與臨床應用仍存在三個(gè)主要問(wèn)題。第一，由于重組人溶菌酶在轉基因動(dòng)物乳腺中表達穩定性差、異位表達、整合率低以及生長(cháng)周期漫長(cháng)、風(fēng)險高、資金回報率不可預測、環(huán)境安全對于是否發(fā)生水平基因漂移等問(wèn)題亟待解決。第二，對于特定疾病、細菌、耐藥菌、真菌、病毒的臨床實(shí)驗室研究還是少數。第三，轉基因生物安全性還需要進(jìn)一步研究，有待于更進(jìn)一步的完善。第四，利用動(dòng)物反應器生產(chǎn)出來(lái)的產(chǎn)品是否會(huì )對當地環(huán)境造成污染，周邊生態(tài)是否會(huì )產(chǎn)生破壞。第五，動(dòng)物福利問(wèn)題。轉基因動(dòng)物產(chǎn)物臨床制品的開(kāi)放是一個(gè)長(cháng)期的過(guò)程， 中間需要大量實(shí)驗室研究、中間試驗、環(huán)境釋放、生產(chǎn)性試驗、安全評估、生物安全福利、倫理學(xué)審查、安全證書(shū)、臨床前研究、臨床前動(dòng)物試驗、臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期試驗，需要逐步積累經(jīng)驗、收集數據，均要進(jìn)行風(fēng)險評估和安全評價(jià)，確保生物安全性。
4. 重組人溶菌酶未來(lái)展望
由于重組人溶菌酶具有安全、無(wú)毒、抗菌譜廣、無(wú)殘留、生物相容性好等特點(diǎn)，具有極其廣闊的應用前景，預測今后的重組人溶菌酶會(huì )在以下幾個(gè)方面開(kāi)展：(1)人溶菌酶基因水平上進(jìn)行結構改造、研究，利用微生物作載體開(kāi)發(fā)具有實(shí)際意義的工程菌，以制取出更大產(chǎn)量、性質(zhì)更加穩定、能夠持續遺傳的產(chǎn)品；(2)進(jìn)行動(dòng)物生物反應器的制造， 并能夠得到目的、安全的表達，解決動(dòng)物福利問(wèn)題，隔絕基因污染；(3)應用于臨床、食品及工業(yè)用途；(4)技術(shù)上攻克研發(fā)瓶頸，降低研究成本。在如今耐藥性細菌泛濫的時(shí)期，能夠早日開(kāi)發(fā)重組人溶菌酶產(chǎn)品，為今后的控制感染、抑制有害細菌、毒素帶來(lái)裨益，會(huì )是未來(lái)的研究方向和趨勢， 相信今后的人溶菌酶一定會(huì )得到廣泛的應用。
參 考 文 獻
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(收稿日期：2017- 06- 10)
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重組人溶菌酶的研究進(jìn)展
龐戀蘇 李亞男
【摘要】 人溶菌酶是一種人體內天然存在的具有抗菌、抗病毒、抗炎、增強免疫力等特性的蛋白質(zhì)。它直接作用于細菌細胞壁，因此，細菌對其完全不存在耐藥性，也無(wú)免疫原性。利用基因工程生產(chǎn)出的重組人溶菌酶不僅具有人溶菌酶的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也克服了人溶菌酶活性低、產(chǎn)量低、不便于制備、無(wú)法穩定保存等缺點(diǎn)。在抗菌藥物濫用、耐藥菌株廣泛存在的今天，由于其特性可以彌補眾多抗生素的不足，具有廣泛的臨床應用前景。本文就針對重組人溶菌酶的研究進(jìn)展做一綜述。
關(guān)鍵詞：溶菌酶；重組人溶菌酶；藥理作用；生物功能
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Research progress of recombinant human lysozyme
PANG Lian-su, LI Ya-nan (Department of stomatology, Chinese PLA General Hospital and Chinese PLA Medical school, Beijing 100853, China)
[ Abstract] Recombinant Human lysozyme is a kind of protein that has antibacterial, anti-viral, anti - inflammatory and immunological properties. Recombinant human lysozyme is a natural antibacterial agent, directly acting on bacterial cell wall. It has no drug resistance in bacteria and immunogenicity. Recombinant human lysozyme not only has the advantage of human lysozyme but also has better antibacterial activity, more production, easy to prepare and stable preservation. It has very promising clinical application prospectespecially bacterial resistant strains are widespread. The research progress of recombinant human lysozyme is reviewed.
Key words: Lysozyme; Recombinant human lysozyme; Pharmacological; Biological functions
* 基金項目：企事業(yè)單位合作課題(項目編號: HXKTLIYANAN001)
龐戀蘇 解放軍醫學(xué)院 碩士生 北京 100853
李亞男 通訊作者 解放軍總醫院口腔修復科副主任醫師 副教授 北京 100853
溶菌酶起源于 1922 年 Fleming 在人的鼻粘液中發(fā)現一種能夠溶解細菌細胞壁的物質(zhì)，并將其命名為“Lysozyme”，即溶解細菌的蛋白質(zhì)。溶菌酶全稱(chēng) 1, 4- β- N 乙酰胞壁酸聚糖水解酶，又稱(chēng)為細胞壁溶解酶，在高等動(dòng)物的體液中分布廣泛，它具有抗菌、抗病毒、消炎、增強免疫力等特性[1]。隨 著(zhù)日益出現的耐藥型細菌以及人體對抗生素類(lèi)藥物的嚴重不良反應，急需要一種新型的無(wú)耐藥性、無(wú)抗原性、無(wú)毒性的抗菌藥物，基因工程技術(shù)的發(fā)展使得重組人溶菌酶得以生產(chǎn)，人們期待將重組人溶菌酶用于臨床。
1. 人溶菌酶的分子結構和理化生物特性
人溶菌酶是由 130 個(gè)氨基酸組成的單肽鏈蛋白質(zhì)，是一種陽(yáng)離子堿性蛋白質(zhì)，呈白色結晶狀或無(wú)定形粉末固相，常溫即可溶于水，化學(xué)性質(zhì)穩定， 最適宜溫度是 25℃，在高溫和酸溶液環(huán)境中活性也保持穩定，堿溶液中不穩定，天然人溶菌酶主要存在于人體體液、組織內外細胞液和人體器官中， 作為一種重要的非特異性體液免疫因子，若缺乏可導致嚴重的免疫系統疾病。溶菌酶在人體唾液中以游離和復合物這兩型存在：
(1)游離型主要是呈團簇狀的陽(yáng)離子蛋白質(zhì)；
(2)復合物型與陰離子蛋白質(zhì)、多糖、大分子物質(zhì)共同組成[2]。細菌細胞壁溶菌酶根據靶向作用的位點(diǎn)不同，可以細分為作用于β- 1, 4 糖苷鍵和作用于肽“尾”這兩種類(lèi)型，溶解真菌的主要是依賴(lài)裂解酵母菌細胞壁和霉菌細胞壁的溶菌酶。
溶菌酶溶菌作用機制是借助于幾種酶或非酶物質(zhì)共同作用溶解細菌細胞壁達到殺菌效果，哺乳動(dòng)物體內細胞無(wú)細胞壁，不存在肽聚糖，溶菌酶無(wú)靶向位點(diǎn)，故對人體細胞不會(huì )產(chǎn)生破壞作用。因為革蘭氏陰性細菌只有內層壁為肽聚糖，而革蘭氏陽(yáng)性細菌細胞壁幾乎全部由肽聚糖組成，所以人溶菌酶抗革蘭氏陽(yáng)性菌效應高于革蘭氏陰性菌[3]。真菌細胞壁中的連接鍵幾丁質(zhì)也是人溶菌酶的底物，人溶菌酶可以使其 β- 1, 4 糖苷鍵斷裂而使細胞壁溶解，并且 PH= 5 是溶解幾丁質(zhì)最好的條件，因此溶菌酶可以溶解真菌細胞壁而治療其引起的感染[4]。人溶菌酶蛋白質(zhì)抗病毒機制是雙方所帶的異種電荷能夠緊密結合在一起，與病毒 DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，破壞病毒內部結構達到使病毒失活的作用[5]。溶菌酶還有改善和增強巨噬細胞細胞免疫的作用，使白細胞增多、減輕內毒素的作用，使機體受損可以通過(guò)加快自身免疫反應并釋放炎癥因子[6]。同時(shí)，人溶菌酶能夠激活血小板、發(fā)揮并加強人體第二道防線(xiàn)功能，從而實(shí)現抗菌、消炎、止疼等作用。人體中溶菌酶的分布和含量體現了某些疾病的發(fā)生、發(fā)展，可作為疾病診斷的重要指標。
2. 重組人溶菌酶藥效學(xué)研究
呂秋軍[7]學(xué)者發(fā)現重組人溶菌酶具有較強的抗菌性能。對革蘭氏陽(yáng)性菌如金葡球菌、表皮葡萄糖球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌活性強，尤其對耐藥菌有效，與其他抗生素聯(lián)用后， 體外抑菌活性明顯增強，還具有抗炎、鎮痛作用， 在急性、長(cháng)期毒性試驗中，wistar 大鼠、獼猴均未發(fā)現毒性靶器官，為后期制備抗耐藥菌新藥提供參考。多項研究實(shí)驗證明，對重組人溶菌酶和溶菌酶標準品抑菌活性的比較試驗中，重組人溶菌酶對致病菌與益生菌的抑菌性能均明顯強于溶菌酶標準品，它表現出更優(yōu)異的低劑量即達到標準溶菌酶的抗菌活性[5]。已有研究證明溶菌酶可以抗冠狀皰疹病毒、腺病毒生長(cháng)，也可用于帶狀皰疹、腮腺炎、雞水痘、肝炎及流感等病毒性疾患的治療[8]，也有研究資料提示，人溶菌酶是抗HIV 感染、抗SARS 的輔助治療藥物[9]。
Tenovuo 等[10]臨床研究顯示，將口腔牙膏與溶菌酶混合可更有效的預防齲齒，效果優(yōu)于直接添加抗菌劑。變形鏈球菌是目前公認的可疑致病菌[11]， 溶菌酶能夠破壞變形鏈球菌的細胞壁完整性達到抗齲的效果。牙周炎[12]主要認為是細菌的菌群紊亂導致，優(yōu)勢菌群的存在，破壞牙周膜細胞從而發(fā)病，
而重組人溶菌酶通過(guò)抑制優(yōu)勢菌可以改善疾病。牙齒釉質(zhì)表面覆蓋的一層薄膜中含有溶菌酶，它可以隔離外界環(huán)境對牙釉質(zhì)的酸蝕破壞，提示可以通過(guò)制備溶菌酶制劑達到護齒的目的。Samaranayake 等[13]體外模型研究發(fā)現，少量的溶菌酶即可抑制念珠菌生物膜的形成。重組人溶菌酶和抗真菌劑同時(shí)使用還具有協(xié)同作用，能夠有效抑制真菌感染。
3. 重組人溶菌酶制備與臨床轉化應用研究
人溶菌酶存在提取困難和活性難以保證等問(wèn)題，現國內生產(chǎn)的溶菌酶制劑主要是從雞蛋的蛋殼和蛋清中提取得來(lái)的，可以進(jìn)行規?；a(chǎn)，并已經(jīng)進(jìn)入臨床應用。國外則以動(dòng)物和霉菌為原料進(jìn)行生產(chǎn)，在大腸桿菌、酵母菌以及動(dòng)物、植物中都有表達重組人溶菌酶的相關(guān)研究。1986 年Murakami[14] 在啤酒酵母中表達出的重組人溶菌酶因為包涵體形式存在而不具有活性，后又在大腸桿菌上表達生產(chǎn)人溶菌酶，但都存在產(chǎn)量小，活性低的問(wèn)題。1988 年 Yoshimura 等[15, 16]學(xué)者通過(guò)接上一段雞溶菌酶信號肽，從而使啤酒酵母分泌了有活性的人溶菌酶。2001 年賈向志等[17]在巴斯得畢赤酵母上得到重組人溶菌酶的表達，但低等宿主中表達的重組人溶菌酶時(shí)常會(huì )以不溶的包涵體形式存在而無(wú)活性， 表達產(chǎn)量也無(wú)法達到要求。經(jīng)過(guò)近 20 年的研究， 采用單分子克隆技術(shù)構建重組表達質(zhì)粒，篩選出能夠高表達的人溶菌酶的工程菌，發(fā)現巴斯得畢赤酵母菌具有高效表達、穩定遺傳的特點(diǎn)，打破了低等生物表達產(chǎn)物活性低的瓶頸。結合巴斯得畢赤酵母營(yíng)養要求低、可高密度發(fā)酵、穩定遺傳性強等優(yōu)點(diǎn)，重組人溶菌酶可以在臨床上廣泛應用?？裳芯恐饾u發(fā)現，從各種微生物原材料中提取人溶菌酶仍存在一些固有缺陷：(1)生物原材料無(wú)法保證每一物種都能夠高產(chǎn)量、穩定表達；(2)物種來(lái)源也容易受到污染，是否在傳代的過(guò)程中不產(chǎn)生物種隔離； (3)生物活性不容易穩定遺傳，持續性無(wú)法得到保證。經(jīng)過(guò)幾十年的研究，現利用 DNA 重組技術(shù)動(dòng)物反應器表達獲得產(chǎn)物就可以克服這些問(wèn)題，通過(guò)轉基因技術(shù)表達重組人溶菌酶與天然人溶菌酶理化性質(zhì)、生物活性總體上無(wú)差別。
2006 年 Murray [18]小組已經(jīng)成功在山羊乳腺中得到表達并穩定遺傳，國內李寧院士[19]的團隊2011 年在奶牛乳腺上得到表達，并獲得高產(chǎn)和穩定遺傳。動(dòng)物乳腺生物反應器生產(chǎn)的重組人溶菌酶與天然人體產(chǎn)生的溶菌酶并無(wú)顯著(zhù)差別[20]。奶牛生物反應器可以高表達出重組人溶菌酶，也可以減少奶牛乳腺炎的發(fā)病率，奶液更加健康，其體內常見(jiàn)益生菌也未受到抑制。重組人溶菌酶還可以提高仔豬抗腹瀉的能力[21, 22]。
由于重組人溶菌酶的廣譜抗菌特性，又安全無(wú)毒副作用，已用在食品加工、副食品產(chǎn)品制作中， 醫療衛生也已經(jīng)有各種溶菌酶藥物劑型，主要應用于上呼吸道感染、口腔等疾病。人溶菌酶作為一種非特異性免疫蛋白，它能夠在自身免疫中發(fā)揮及其重要的作用，是人類(lèi)機體免疫的第一道防線(xiàn)。對口腔內牙周炎、齲齒、復發(fā)性阿弗他潰瘍、扁平苔蘚、智齒冠周炎、天皰瘡的治療均有一定作用[23]。我國復旦大學(xué)學(xué)者[24]進(jìn)行了多中心、隨機、雙盲、 多劑量平行對照評價(jià)重組人溶菌酶噴霧劑治療咽炎、扁桃體炎的療效及安全性的研究，現提示療效及安全性均較好，但缺乏長(cháng)期的臨床試驗觀(guān)察及數據分析，臨床上應用仍需要進(jìn)一步數據支持。
3. 重組人溶菌酶研發(fā)的優(yōu)勢與存在的問(wèn)題
綜上，重組人溶菌酶是一種廣譜抗菌、抗病毒藥物，能夠有效殺死毒性微生物并保護自身不受損害，同時(shí)與其他藥物相互作用無(wú)交叉反應。具有上述優(yōu)點(diǎn)，使得重組人溶菌酶可以在畜牧業(yè)、食品產(chǎn)業(yè)、臨床治療中得到發(fā)展。因為它的應用十分廣泛，也引起了世界衛生組織、糧食農業(yè)組織的重視，現已經(jīng)用來(lái)抗仔豬腹瀉病、抗山羊、奶牛乳腺炎，也可以做食品的防腐劑，已用在青稞、肉制品、以及牛奶的保質(zhì)防腐等用途上?，F在已經(jīng)進(jìn)行藥用生產(chǎn)的主要是雞蛋蛋清溶菌酶，而它僅是重組人溶菌酶活性的 1/ 3，同時(shí)由于異源性對人體有免疫排斥反應，也無(wú)法對抗機體內的細菌、病毒等。人溶菌酶熱穩定性也要遠高于雞蛋清溶菌酶，蛋清溶菌酶較于人溶菌酶抗菌譜較窄，而且人溶菌酶還有多種自身獨有的藥理作用，如抗炎、抗病毒、增強免疫力及抗腫瘤等。
目前用于商品化的人溶菌酶多從人乳汁和胎盤(pán)中提取，存在著(zhù)來(lái)源受限、產(chǎn)量極低、質(zhì)量不穩定、含有未知病原、價(jià)格高昂等問(wèn)題，不能滿(mǎn)足于市場(chǎng)需求。對于重組人溶菌酶的大規?；a(chǎn)與臨床應用仍存在三個(gè)主要問(wèn)題。第一，由于重組人溶菌酶在轉基因動(dòng)物乳腺中表達穩定性差、異位表達、整合率低以及生長(cháng)周期漫長(cháng)、風(fēng)險高、資金回報率不可預測、環(huán)境安全對于是否發(fā)生水平基因漂移等問(wèn)題亟待解決。第二，對于特定疾病、細菌、耐藥菌、真菌、病毒的臨床實(shí)驗室研究還是少數。第三，轉基因生物安全性還需要進(jìn)一步研究，有待于更進(jìn)一步的完善。第四，利用動(dòng)物反應器生產(chǎn)出來(lái)的產(chǎn)品是否會(huì )對當地環(huán)境造成污染，周邊生態(tài)是否會(huì )產(chǎn)生破壞。第五，動(dòng)物福利問(wèn)題。轉基因動(dòng)物產(chǎn)物臨床制品的開(kāi)放是一個(gè)長(cháng)期的過(guò)程， 中間需要大量實(shí)驗室研究、中間試驗、環(huán)境釋放、生產(chǎn)性試驗、安全評估、生物安全福利、倫理學(xué)審查、安全證書(shū)、臨床前研究、臨床前動(dòng)物試驗、臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期試驗，需要逐步積累經(jīng)驗、收集數據，均要進(jìn)行風(fēng)險評估和安全評價(jià)，確保生物安全性。
4. 重組人溶菌酶未來(lái)展望
由于重組人溶菌酶具有安全、無(wú)毒、抗菌譜廣、無(wú)殘留、生物相容性好等特點(diǎn)，具有極其廣闊的應用前景，預測今后的重組人溶菌酶會(huì )在以下幾個(gè)方面開(kāi)展：(1)人溶菌酶基因水平上進(jìn)行結構改造、研究，利用微生物作載體開(kāi)發(fā)具有實(shí)際意義的工程菌，以制取出更大產(chǎn)量、性質(zhì)更加穩定、能夠持續遺傳的產(chǎn)品；(2)進(jìn)行動(dòng)物生物反應器的制造， 并能夠得到目的、安全的表達，解決動(dòng)物福利問(wèn)題，隔絕基因污染；(3)應用于臨床、食品及工業(yè)用途；(4)技術(shù)上攻克研發(fā)瓶頸，降低研究成本。在如今耐藥性細菌泛濫的時(shí)期，能夠早日開(kāi)發(fā)重組人溶菌酶產(chǎn)品，為今后的控制感染、抑制有害細菌、毒素帶來(lái)裨益，會(huì )是未來(lái)的研究方向和趨勢， 相信今后的人溶菌酶一定會(huì )得到廣泛的應用。
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(收稿日期：2017- 06- 10)
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